Научный журнал
Современные наукоемкие технологии
ISSN 1812-7320
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,021

ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА АНАЛИЗА В КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ СУММЫ СВОБОДНЫХ ?-АМИНОКИСЛОТ

Гумеров Т.Ю. 1 Фахразиева З.Р. 1 Федотов С.А. 1
1 ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева-КАИ»
Обеспечение безопасности продовольственного сырья, пищевых продуктов и готовых блюд – одно из основных направлений, определяющих здоровье населения. Правильно организованный и осуществленный технологический процесс приготовления блюд и изделий позволяет полностью исключить присутствие в готовых блюдах патогенных микроорганизмов, уменьшить содержание радионуклидов и нитратов, а также сохранить ценные белки, жиры и углеводы. Общественное питание является важным структурным элементом социальной инфраструктуры, роль общественного питания достаточно значима и направлена на выполнение главной функции – создание комплекса условий для развития экономики и обеспечения нормальной жизнедеятельности человека.
спектрофотометрия
аминокислоты
зерновое сырье
1. Виноградов В.Ю. Экологические способы сжигания хозяйственных отходов / В.Ю. Виноградов, А.А. Сайфуллин, А.М. Загртдинов // Молодой ученый. – 2015. – № 12. 1(92). – 15 с.
2. Гумеров Т.Ю. Оценка качества различных сортов картофеля при их кулинарной обработке. / Т.Ю. Гумеров, О.А. Решетник // Вестник КГТУ. – 2011. – №16. – 178 с.
3. Гумеров Т.Ю. Изменение витаминного состава картофеля при различных способах кулинарной обработки. / Т.Ю. Гумеров, О.А. Решетник // Вестник КГТУ. – 2011. – № 17. – 134 с.
4. ГОСТ 7047-89. Витамины А, С, D, B1, B2 и РР. Отбор проб, методы определения витаминов и испытания качества витаминных препаратов. – Введ. 2001–01–90. – М.: Изд-во стандартов, 1989. – 56 с.
5. ГОСТ Р53104-2008. Услуги общественного питания: «Метод органолептической оценки качества продукции общественного питания». – Введ. 2001–01–09. – М.: Изд-во Госстандарт России, 2008. – 35 с.
6. Мурашова С.Ю. Роль и место общественного питания в современной системе хозяйствования / С.Ю. Мурашова. – М: Колос, 2004. – 103 с.
7. Роева Н.Н. Лабораторный практикум по методам исследования свойств сырья и пищевых продуктов / Н.Н. Роева, Ю.А. Клячко, В.К. Кирничная. – М.: МГТА, 2000. – 156 с.
8. Симонян А.В. Использование нингидриновой реакции для количественного определения ?-аминокислот в различных объектах: методические рекомендации / А.В. Симонян, Ю.С. Саламатов, Ю.С. Покровская. – Волгоград, 2007. – 106 с.

Питание, как процесс употребления пищи удовлетворяет самую насущную потребность человека, выступает необходимым условием существования людей, их общественной и трудовой деятельности. Общественное питание в своих коллективно организованных формах является важнейшим фактором и механизмом реализации социальной политики [7].

Целью работы являлось адаптировать спектрофотометрический метод для количественного определения α-аминокислот в зерновом сырье на основе исследования спектральных характеристик продуктов нингидроновой реакции.

Исходя из цели, были сформулированы следующие задачи:

– адаптировать метод спектрофотометрии и изучить спектральные характеристики в видимой и УФ-области оптической плотности водных растворов экстрактов зернового сырья;

– определить количественный состав заменимых и незаменимых аминокислот с применением 0,2 % раствора нингидрина;

– оптимизировать условия проведения кислотного гидролиза экстрактов образцов с целью повышения выхода суммы α-аминокислот из зернового сырья;

– изучить влияние продолжительности гидролиза на выход суммы α-аминокислот;

– изучить влияние балластных веществ на содержание суммы α-аминокислот в зерновом сырье после гидролиза (в оптимизированных условиях).

На начальном этапе эксперимента проводились исследования спектральных характеристик продуктов реакции α-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в воде.

В качестве исследуемых образцов было подобрано зерновое сырье, выращенное в различных районах Республики Татарстан. Данные исследования проводились с целью выявления наиболее ценного зернового сырья в зависимости от географического места расположения, климатических условияй и метеорологических особенностей выращивания зерна. Кроме того, выявление генетических особенностей различных сортов зерна и влияние внешних условий при выращивании (одинаковые условия возделывания, дозы и соотношение удобрений, применение различных препаратов, условия, влияющие в значительной степени на биохимический состав). В работе рассмотрено 10 образцов со следующим обозначением: О-1; О-2; О-3; О-4; О-5; О-6; О-7; О-8; О-9 и О-10. Каждый образец отличается внешними признаками, формой, цветом, размером, а также районом выращивания и периодом созревания [8].

Изучение спектральных характеристик проводилось на спектрофотометре ПЭ-5300 ВИ в лаборатории биохимического анализа кафедры ТПП КНИТУ. Зерновое сырье (образцы) подверглось экстрагированию с получением водной эмульсии [1].

В результате исследования водных растворов образцов на спектрофотометре были получены следующие результаты в виде спектров поглощения оптической плотности (рис. 1).

gum1.wmf

Рис. 1. УФ-область спектра продуктов взаимодействия экстракта зерновых культур с 0,2 % раствором нингидрина в воде: где D – оптическая плотность, λ – длина волны, нм

 

В результате эксперимента установлено, что для всех исследуемых образцов зерновых культур характерны четыре максимума поглощения, два из которых находятся в УФ-области, в интервале 220–240 и 250–260 нм, и два – в видимой области, в диапазоне 380–400 и 560–580 нм. Данная закономерность наблюдается для всех исследуемых образцов и объясняется наличием первичных аминогрупп α-аминокислот в структуре зернового сырья.

Таким образом, большинство продуктов реакции α-аминокислот с раствором нингидрина в воде характеризуется единым максимумом поглощения при длине волны 400 нм, что обусловливает целесообразность использования данной длины волны в качестве аналитической (табл. 1) [2].

Таблица 1

Характеристика спектров поглощения продуктов реакции α-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина

Максимум

поглощения, нм

Образец

О-1

О-2

О-3

О-4

О-5

О-6

О-7

О-8

О-9

О-10

Видимая область

400,56

400,56

400,47

399,56

400,53

400,65

400,65

400,56

400,78

400,49

УФ-область

230,25

230,25

230,25

230,25

230,34

230,25

230,25

230,31

230,33

230,37

В работе [5] установлено, что водный раствор нингидрина имеет интенсивное поглощение в диапазоне длин волн 220 до 330 нм, но совершенно не поглощает в диапазоне длин волн 400–600 нм. Поэтому целесообразно проводить спектрофотометрические исследования продуктов реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина в видимой области спектра.

Далее в работе было определено количественное содержание аминокислот в исследуемых образцах в соответствие с методикой [8]. Данная реакция впервые была открыта Руманом. Позднее установлено, что нингидрин специфичен к алифатическим или алициклическим первичным аминогруппам. Вторичные, третичные и четвертичные амины, амиды и амино-замещенные ароматические соединения дают слабую реакцию или не дают вовсе. Исключение – пролин, который образует с нингидрином окраску желтого цвета, как считают некоторые исследователи, благодаря раскрытию цикла.

Свободные α-аминокислоты дают сине-фиолетовое окрашивание с нингидрином. На первой стадии реакции α-аминокислот с нингидрином образуются углерода диоксид, альдегид и устойчивое промежуточное соединение 2-аминоиндандион, участвующий в двух параллельных реакциях. В одной из них он реагирует с нингидрином до образования 2-гидроксииндандиона и 2-иминоиндандиона, которые, конденсируясь между собой, формируют дикетогидринденкетогидринамин. Во второй реакции 2-аминоиндандион в кислой среде подвергается гидролизу до аммиака и 2-гидроксииндандиона, последний, взаимодействуя с нингидрином, образует гидриндантин.

Далее, проводились исследования спектральных характеристик образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина после нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин. Для этого в исследуемых образцах, после проведения нингидриновой реакции, определяли оптимальные значения их оптических плотностей.

В водном извлечении зернового сырья аминокислоты содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии (в составе пептидов и белков). С целью повышения выхода суммы аминокислот из зернового экстракта в работе были оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза.

В качестве гидролизующего агента был использован раствор хлороводородной кислоты, обеспечивающий достаточно полное расщепление белков и пептидов водного экстракта до α-аминокислот. Кроме того, получаемые гидролизаты характеризуются высокой стабильностью, уменьшается вероятность их микробной контаминации, что является важным фактором при подготовке образцов к анализу.

На следующем этапе исследования был изучен аминокислотный состав зернового сырья после кислотного гидролиза. Следует отметить, что несмотря на высокий выход α-аминокислот, проведение кислотного гидролиза в данных условиях связано с воздействием повышенного давления на сырье, сложным аппаратурным оформлением процесса, а также со значительными временными затратами при подготовке гидролизата (более 20 ч), что ограничивает использование данной технологии в условиях промышленного производства. На этом основании целью являлось оптимизировать условия кислотного гидролиза для повышения выхода аминокислот из сырья и разработать доступную методику. К 5 г зернового сырья добавляли 35 мл воды и оставляли на 30 мин. Далее к сырью добавляли 65 мл раствора хлороводородной кислоты в концентрации от 0,5 М до 5 М и проводили гидролиз при температуре 80–90 °С в течении 2 ч. Затем гидролизат отделяли фильтрованием, а сырье для его более полного истощения четырехкратно экстрагировали водой (в соотношении 1:6) по 30 мин в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтровали и объединяли с гидролизатом.

К объединенному гидролизату добавляли натрий гидрокарбонат до нейтральной реакции, переносили в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводили водой до метки. В результате кислотного гидролиза образуется комплекс балластных веществ (в том числе и продукты частичного гидролиза ВМС), снижающих качество готового продукта. Для очистки от данных веществ, к 25 мл гидролизата добавляли трехкратный объем 96 % этанола и оставляли в течение 10–12 ч при температуре 3–4 °С. Образующийся осадок отделяли центрифугированием, после чего извлечение сгущали до полного удаления этанола, переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили водой до метки.

Далее проводилась нингидриновая реакция. Установлено, что гидролиз зернового сырья 1 М раствором хлороводородной кислоты обеспечивает наиболее высокий выход суммы аминокислот – до 0,94 % в пересчете на конкретную аминокислоту (рис. 2).

gum2a.wmf gum2b.wmf

а) б)

gum2c.wmf gum2d.wmf

в) г)

Рис. 2. Количественное содержание незаменимых α-аминокислот в образцах: а) образцы О-1; О-2; О-3; б) образцы О-4; О-5; О-6; в) образцы О-7; О-8; г) образцы О-9; О-10

Как видно из рисунков, количественное содержание незаменимых α-аминокислот в образцах незначительно варьируется, наиболее обогащенными можно выделить образцы О-2, О-4, и О-10, в которых количество незаменимых аминокислот на 20–30 % превышает остальные. Образец О-5 характеризуется наименьшими количественными характеристиками по всем незаменимым аминокислотам [3].

Анализ количественного содержания заменимых аминокислот показал следующие результаты: образцы О-1, О-2, О-4 и О-10 характеризуются наибольшим количественным содержанием заменимых аминокислот (8,91 %, 9,623 %, 9,228 % и 9,487 %), а образец О-5 с наименьшим (6,465 %).

Данные результаты позволяют определить наиболее ценные сорта зерна для использования в технологической линии производства отдельных видов сырья и продукции. Наиболее ценные по аминокислотному составу образцы рекомендуется использовать для приготовления продукции диетического и функционального назначения, а менее ценные образцы – на производство кондитерских и макаронных изделий.

В следующей части эксперимента было изучено влияние продолжительности гидролиза на выход суммы аминокислот.

Кислотный гидролиз, 1 М HCl, проводился в интервале времени 1, 3, 6 и 9 часов. Установлено, что наибольший выход суммы аминокислот из зернового сырья наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 6 часов. На нейтрализацию полученного извлечения израсходовано 5 г натрия гидрокарбоната [4]. Данные по оптимизации условий проведения кислотного гидролиза зернового сырья приведены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние регулируемых факторов кислотного гидролиза на выход суммы α-аминокислот зернового сырья

№ п/п

Концентрация раствора HCl, М

Время гидролиза, ч

Выход суммы АК, %

1

0,5

1

77,2

3

79,1

6

80,4

9

82,2

2

1,0

1

84,3

3

87,1

6

94,7

9

91,6

3

1,5

1

88,4

3

73,5

6

74,2

9

79,5

4

2,0

1

81,4

3

82,1

6

87,3

9

67,1

5

2,5

1

85,8

3

86,4

6

86,3

9

85,1

6

3,0

1

71,2

3

76,3

6

73,1

9

72,8

7

3,5

1

67,4

3

66,2

6

65,3

9

68,1

8

4,0

1

66,3

3

68,5

6

67,3

9

65,1

9

5,0

1

58,2

3

59,3

6

57,4

9

57,1

Таким образом, в работе оптимизированы условия кислотного гидролиза: к 5 г зернового сырья (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния, добавляли 35 мл воды дистиллированной и оставляли на 30 мин для набухания. Затем к набухшему сырью добавляли 65 мл 1 М раствора хлороводородной кислоты и проводили гидролиз при температуре 80–90 °С в интервале до 9 часов.

С целью изучения влияния балластных веществ на содержание суммы α-аминокислот в зерновом сырье после гидролиза (в оптимизированных условиях) были приготовлены кислотные гидролизаты без очистки и с очисткой от балластных веществ с последующим проведением нингидриновой реакции. Результаты представлены на примере незаменимой аминокислоты α-валин (рис. 3).

gum3.wmf

Рис. 3. Содержание незаменимых аминокислот в образцах с центрифугированием и без

 

По результатам диаграмм (по всем незаменимым аминокислотам) видно, что образцы подвергнувшиеся удалению балластных веществ методом центрифугирования, характеризуются содержанием незаменимых аминокислот на 1,5–2,7 % больше, чем в образцах без удаления балластных веществ. Так как исходное извлечение водного экстракта зернового сырья содержит вещества, реагирующие с нингидрином (а именно пептиды и белки), влияющие на изменение значений оптической плотности, может дать ошибку результат количественного содержания α-аминокислот. Поэтому для получения достоверных результатов, отражающих количественное содержание суммы α-аминокислот в растительном сырье, необходимо проводить доочистку от сопутствующих ВМС с помощью осаждения этанолом. Результаты количественного содержания суммы α-аминокислот в исследуемых образцах представлены в табл. 3.

Таблица 3

Суммарное содержание α-аминокислот в зерновом сырье

Образцы

О-1

О-2

О-3

О-4

О-5

О-6

О-7

О-8

О-9

О-10

Содержание АК, %

14,8

10,06

15,32

15,35

10,76

13,18

13,38

13,17

13,38

15,76

Статистическая обработка метода количественного определения суммы α-аминокислот в зерновом сырье характеризуется достаточно высокой точностью определения и воспроизводимостью. Относительная ошибка результатов определения для всех образцов не превышает ± 3 %.

В результате эксперимента были оптимизированы методы определения α-аминокислот в зерновом сырье, определены количественные характеристики незаменимых и заменимых аминокислот, а также определено их общее содержание с целью выявления образцов наиболее подходящих в технологии производства отдельных видов пищевого сырья [5].

Выводы

В работе проведена адаптация и оптимизация спектрофотометрического метода в количественном анализе суммы свободных α-аминокислот зернового сырья. На основе исследования спектральных характеристик продуктов нингидроновой реакции подобраны условия проведения биохимических исследований водных экстрактов образцов:

– исследованы спектральные характеристики продуктов реакции α-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в видимой и УФ-области излучения;

– установлено, что, спектры поглощения в видимой области характеризуются наличием двух максимумов в диапазонах длин волн 380–400 и 560–580 нм, а также исследована УФ- область спектра поглощения продуктов реакции с 0,2 % раствором нингидрина, где установлено наличие двух максимумов в диапазонах длин волн 220–240 и 250–260 нм;

– определено, что большинство продуктов реакции α-аминокислот с раствором нингидрина в воде характеризуется единым максимумом поглощения при длине волны 400 нм, что обусловливает целесообразность использования данной длины волны в качестве основной аналитической;

– с целью повышения выхода суммы α-аминокислот из зернового экстракта были оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза при использовании 1 М раствора хлороводородной кислоты;

– оптимизированные условия проведения кислотного гидролиза повысили выход α-аминокислот из сырья до максимального показателя 94,7 %;

– установлено, что наибольший выход суммы α-аминокислот из зернового сырья наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 6 часов;

– определено, что удаление балластных веществ в образцах методом центрифугирования приводит к увеличению точности определения содержания незаменимых аминокислот на 1,5–2,7 %.


Библиографическая ссылка

Гумеров Т.Ю., Фахразиева З.Р., Федотов С.А. ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА АНАЛИЗА В КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ СУММЫ СВОБОДНЫХ ?-АМИНОКИСЛОТ // Современные наукоемкие технологии. – 2015. – № 12-2. – С. 219-224;
URL: http://www.top-technologies.ru/ru/article/view?id=35241 (дата обращения: 27.10.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074