Целью настоящей работы явилось совершенствование технологии получения гидролизата соевой муки с использованием протеолитического растительного фермента бромелайна, конструирование питательной среды на основе полученного гидролизата и оценка возможности ее применения для культивирования клеток млекопитающих.
Условия эксперимента
В качестве субстрата для гидролиза была использована соевая мука высшего сорта. В качестве протеолитического растительного фермента применяли бромелайн («Sigma», США). Физико-химические свойства гидролизатов оценивали по следующим показателям: внешний вид, цвет, запах - органолептически; концентрацию ионов водорода 1%-ного раствора - потенциометрически; массовую долю влаги - весовым методом в соответствии с ФС 42-3874-99; растворимость - путем учета времени полного растворения 5 г гидролизата в 100 мл очищенной воды. Аминный азот определяли методом формольного титрования по ФС 42-3874-99, белковый общий азот и остаточный азот в безбелковом фильтрате - колориметрическим методом с реактивом Несслера по ФС 42-3874-99. Коэффициент аминный рассчитывали по отношению массовой доли аминного азота к массовой доле общего, коэффициент протеолиза - по отношению массовой доли остаточного азота к массовой доле общего. Аминокислотный состав гидролизатов определен на аминокислотном анализаторе "Мультихром" в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ Баратовой Л.И.
В работе использовали культуры клеток MDCK (клетки почки взрослой самки кокер-спаниеля), Vero (клетки почки зеленой мартышки), BHK-21 (клетки почки новорожденного сирийского хомячка), полученные из музея клеточных культур ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Ростстимулирующую активность питательных сред оценивали путем культивирования клеточных линий в течение 5 последовательных пассажей в культуральных флаконах площадью 25 см2. Посевная доза составляла 1,0×105 клеток в 1 мл для клеточных линий MDCK и Vero и 0,5×105 клеток в 1 мл для BHK-21. Пересев осуществляли через 3-4 суток после формирования монослоя. Для снятия клеток использовали 0,25 % раствор трипсина и 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1. Учитывали сроки образования монослоя, морфологию клеток и индексы пролиферации. Величина индекса пролиферации рассчитывалась как отношение количества выросших клеток к исходному в пяти повторах для каждого эксперимента. В качестве контрольных использовали питательные среды ДМЕМ и Игла МЕМ, производства ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» с добавлением 2, 3 и 5% сыворотки крови плодов коровы (СКПК) («Gibco», США) или 10% сыворотки крови крупного рогатого скота
(ООО «Биолот», Санкт-Петербург).
Данные представленные для обсуждения представляют собой статистически обработанные результаты экспериментов с использованием общепринятых методов вариационной статистики.
Результаты и обсуждение
Методика получения ферментативных гидролизатов из муки растительных злаков с использованием протеолитического фермента трипсина нами подробно описана ранее [1, 2]. Разработанные нами питательные среды на основе ферментативных (с использованием трипсина) гидролизатов рисовой и соевой муки обладали высокими ростстимулирующими свойствами для перевиваемых культур клеток MDCK и Vero, при этом вируспродукция на обеих клеточных культурах, выращенных в питательных средах на основе гидролизатов, была высокой как для холодоадаптированных вакцинных штаммов вирусов гриппа А и В, используемых в живых гриппозных вакцинах, так и для штаммов, рекомендованных ВОЗ в 2007-2008 г. в качестве вакцинных в составе инактивированных гриппозных вакцин. В целях исключения из технологии получения противогриппозных вакцин компонентов животного происхождения, как источника возможной контаминации чужеродными агентами, нами проведена оценка возможности использования для получения ферментативного гидролизата соевой муки вместо фермента животного происхождения - трипсина, растительной протеазы - бромелайна. Бромелайн выделяется из зрелых стеблей ананаса (Ananas) семейства бромелиевых, является тиоловой протеазой, имеющей в составе активного центра сульфгидрильную группу цистеина.
Полученные ферментативные гидролизаты соевого белка с помощью фермента бромелайна по описанной ранее методике [1, 2] были изучены по физико-химическим свойствам и испытаны в составе питательных сред для культивирования клеточных линий млекопитающих. Сухие ферментативные гидролизаты соевой муки представляют собой тонкодисперсные порошки белого или светло-кремового цвета с характерным запахом. Растворы гидролизатов 1%-ой концентрации имеют значения рН 5,5-6,8, время растворения 5 г гидролизата в 100 мл воды очищенной не превышало 2 мин, остаточная влажность - не более 3%. Массовая доля азота общего в гидролизатах составляет 8,83±0,37 % , массовая доля азота аминного - 4,50±0,14%, аминный коэффициент равен 0,51, а коэффициент протеолиза - 0,90. При этом исследуемый соевый гидролизат содержит все незаменимые аминокислоты в оптимальных соотношениях.
На основе полученного гидролизата была сконструирована питательная среда для культур клеток млекопитающих. Для приготовления среды 7 г гидролизата растворяли в 1 л сбалансированного раствора Хенкса, в который дополнительно вводили 1 г глюкозы и комплекс витаминов в количестве 22,5 г/л.
Оценку пригодности гидролизатов для культуральных питательных сред проводили путем определения способности гидролизатной среды обеспечивать образование монослоя и пролиферацию перевиваемых культур клеток. Для этой цели применяли наиболее широко используемые для производства вакцин клеточные культуры MDCK, Vero и BHK-21. Полученные результаты подтверждают, что при культивировании клеток Vero пролиферативная активность среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки с добавлением 5% сыворотки крови плодов коровы (СКПК) была сравнима с контролем и составила 4,9±0,3. При снижении концентрации СКПК до 3% пролиферативная активность экспериментальной среды оставалась высокой и сопоставимой с величиной индексов пролиферации (ИП) контрольной среды, содержащей 5% СКПК. Экспериментальная среда с пониженной концентрацией сыворотки крови обеспечивала формирование монослоя клеток с типичной морфологией на 3-4 сутки. Снижение концентрации СКПК в контрольной среде до 3% приводило к заметному снижению индексов пролиферации культуры, отсутствию формирования монослоя.
Для культуры клеток MDCK ростстимулирующая активность ПС на основе гидролизата сои, полученной с бромелайном, даже в малосывороточном варианте (2% СКПК) остается высокой (ИП=5,1±0,1) и сравнимой с активностью синтетической среды ДМЕМ, содержащей 5% СКПК (ИП=5,0±0,1). При этом клетки сохраняли типичные морфологические черты линии без дегенеративных изменений и образования симпластов, имели полигональную форму и четкие границы, характерные для культур эпителиоидного типа.
Кроме того, показана пригодность экспериментальной гидролизатной среды для культивирования клеток ВНК-21 (С.13), используемых для производства ветеринарных вакцин. Индексы пролиферации культуры ВНК-21 (С.13) после 5-го пассажа в экспериментальной и контрольной средах, содержащих 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, были сопоставимы и равны 9,6±0,3 и 9,4±0,4, соответственно. Морфологическая характеристика клеток выросших в экспериментальной среде оставалась типичной для данного типа клеток и не отличалась от таковой в контрольной среде.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана технология приготовления питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием растительного протеолитического фермента бромелайна. Приготовленная питательная среда может успешно применяться для культивирования перевиваемых клеточных культур MDCK, Vero и BHK, используемых, в частности, в качестве субстрата для культуральных медицинских и ветеринарных вакцин. Использование среды на основе соевого гидролизата для клеточных культур MDCK и Vero позволяет снизить содержание сыворотки крови в питательной среде до 2-3%, соответственно, при этом среда с пониженной концентрацией сыворотки обладает такими же ростовыми характеристиками, как и традиционные питательные среды, содержащие 5-10% сыворотки.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Кирова Е.В., Сумкина Т.П., Юдин А.В. Совершенствование технологии приготовления питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки // Биотехнология. - 2006. - № 4. - С. 74-78.
- Сумкина Т.П., Мартынец Л.Д., Трошкова Г.П. Оптимизация питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки для культивирования клеток млекопитающих //Сб. научных трудов. Под ред. И.Г. Дроздова. Достижения современной биотехнологии. - Новосибирск. - 2008. - С. 312-317.
Библиографическая ссылка
Трошкова Г.П., Мазуркова Н.А., Сумкина Т.П., Мартынец Л.Д., Шишкина Л.Н., Карабинцева Н.О. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА СОИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА БРОМЕЛАЙНА И ОЦЕНКА РОСТОВЫХ СВОЙСТВ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК // Современные наукоемкие технологии. – 2010. – № 1. – С. 45-47;URL: https://top-technologies.ru/ru/article/view?id=24370 (дата обращения: 20.04.2024).